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扩增杂 质浓度的增加使新合成产物3'末端附加dA的频率下降
发表日期:2019/7/16       点击:194

商品化的T _载体以线性DNA形式提供,每条链的3'端都有一个T核苷酸 突出端。PCR产物不需要作进一步的酶修饰处理,就可直接克-在载体上。T- 载体也可以自己制备。较常用的一个方法是利用一种产生平末端的限制性内切核 酸酶(如:&RV, SI等)消化质粒载体(步骤1),然后利用:Ta<?聚合 酶的类似于末端转移酶的特性,将平末端的线性载体在仅有dTTP存在的情况 下,在载体3'末端附加一个dT (步骤2)。进行正常的PCR扩增,最后延伸 15min以补平CR产物并获得A的尾巴(步骤3)。最后将PCR产物纯化回收 (步骤4)后与制备好的T-载体连接(步骤5)〇过程如图3-8所示。

Tag聚合酶在PCR产物上附加dA的程度是由反应近结束时的酶活性以及 在反应体系中聚合酶与全部双链DNA量的比例决定的。假如酶活性低,大 多数分子不附加dA。另外,扩增杂质(即非目的扩增产物,包括很短的类似于 引物二聚体的DNA错误片段)的量要比特异产物的量大的多,将竞争抑制目的 扩增产物附加dA。因此为了使PCR产物最大比例地获得附加的dA,PCR反应 最好不要超过20个循环。因为20个循环以后,酶的活性下降,或者由于扩增杂 质浓度的增加使新合成产物3'末端附加dA的频率下降。

利用TA克隆进行PCR产物的克隆应注意:①Ta9聚合酶在PCR产物上附 dA的特性虽然不依赖于模板,但是依赖于序列。当PCR产物3'末端核苷酸

实验13 PQ^产物的T/A克隆

为A, C或T时,PCR产物3'末端添加A;而当PCR产物3'末端核苷酸为G时, 添加的是G而非A;另外3'末端核苷酸为A时,添加效率最低;②一些新的有 校读功能的热稳定DNA聚合酶,如:P/«, ~无法进行TA克隆。

一、材料、试剂和仪器

1。材料PCR产物、pBluescriptll KS +载体质粒

2•试荆酚/氯仿、无水乙醇、70%乙醇、£〇>R V、T叫酶、dTTP、10X扩增 缓冲液、T4DNA连接酶试剂、灭菌ddH20

3.仪器恒温水浴锅、电泳设备、PCR仪

二、实验程序

1.利用TagDNA聚合晦制备T -载体

(1) 利用一种产生平末端的限制性内切核酸酶(如:&RV,Sttuz I等) 消化5M上海11选5走势图g质粒载体pBluescriptll KS +,取部分在琼脂糖微型凝胶上检査是否酶

切完全。

上海11选5走势图 (2) 70C加热lOmin灭活限制酶。

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第三章PCR相关技术

(3)用酚/氯仿,氯仿抽提后,

两倍体积无水乙醇沉淀质粒载体〇 12 OOOrpm

离心5min,所得沉淀用70%乙醇漂洗后,晾干,溶于25jxl灭菌ddH2Q中。

(4)准备下述加样反应体系

 

平端载体DNA

xfA (5fxg)

10 x扩增缓冲液

lOfil

lOOmmol/LdTTP

2fil

TaqE (5U/^1)

iMi

灭菌ddH20

XfJ。1

 

lOOfxl

70X:温育 2hr。

 

(5)用酸/氯仿,氯仿抽提后,

两倍体积无水乙醇沉淀,70%乙醇漂洗,再

溶于lOOjul灭菌ddH20中,浓度调至50ng/pl。

2.连接反应

 

(1)在冰上混合下列试剂:

 

5X连接缓冲液

2fxl

T-载体

l^tl (50ng)

PCR产物

XM1 (载体摩尔数的3倍)

T4连接酶

lfil (1~2 个 Weiss 单位)

灭菌ddHzO

XfJ。1

l〇tA

(2) 16X:保温过夜。

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